Поиск Кабинет

3D-культивировaние: от отдельных клеток к регенерационной ткани

Гены & Клетки: Том V, №2, 2010 год, стр.: 75-86

 

Авторы

Сабурина И.Н., Репин В.С.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Феномену эпителио-мезенхимальной пластичности муль-типотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), наблюдаемому в 2D культурах, до сих пор не найдено удовлетворительного объяснения. Новые возможности открывает 3D культивирование ММСК, которое моделирует закономерности образования слоев эпителиальных клеток (ламинацию). Проведенный анализ собственных и литературных данных позволил предположить, что именно спонтанное формирование ММСК-сфероидов индуцирует образование регенерационной («бластемной») ткани в фетальных и взрослых органах при повреждении. Продемонстрирована возможность репрограммирования плотных сфероидов ММСК в нейроэктодерму и примитивную энтодерму.

В предыдущих исследованиях было показано, что высоко очищенные культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) человека и млекопитающих формируют три типа адгезированных на пластике колоний: 1) типичные фибробластоподоб-ные (мезенхимальные) 2D кластеры; 2) эпителиоид-ные колонии из распластанных поляризованных по апикально-базальной оси клеток и 3) смешанные эпи-телио-мезенхимальные 2D колонии из эпителиоподоб-ныхи фибробластоподобных (стромальных) клеток[1 — 3]. При длительном культивировании и пассировании эпителиальные и смешанные 2D колонии исчезают из культур и только мезенхимальные колонии стабильно выживают in vitro. D. Zipori предположил, что ММСК in vitro находятся в двух устойчивых эпигенетических состояниях[4]. Однако найти функциональное объяснение эпителио-мезенхимальной пластичности клеток в 2D культурах не удалось.

Не понятно также, какую роль играет обратимая эпителио-мезенхимальная пластичность клеток в 30-культурах. Известно, что закладка, паттернинг и осевое формирование органов, включая органы чувств, реализуются за счет сложных сигнальных сетей и каскадов, управляющих взаимодействием эпителия и стромы (плакоды и папиллы). При развитии зародыша обнаружены первичные, вторичные и третичные циклы обратимых эпителио-мезенхимальных конверсий клеток[5, 6]. Взаимосвязь эпителио-мезенхимальной пластичности клеток с морфогенезом стало возможным изучать в ЗО-системах, в которых были минимизированы цитодифференцировка адгезированных клеток и вклад экстрацеллюлярного матрикса. Любые клетки органа теряют организацию и естественные связи с экстрацеллюлярным матриксом и другими компонентами ткани в плоской культуре. В 3D культуре клетки на коллагеновом матриксе, базальной мембране или матригеле частично восстанавливают организацию и функции через взаимодействия клетка-матрикс. В случае формирования клеточных сфероидов они восстанавливают организацию ткани через избирательные межклеточные взаимодействия. Каждый из подходов позволяет оценить роль клеточных и внеклеточных факторов в морфогенезе. Очень часто в культуре наблюдается генетический и сигнальный антагонизм между программами, контролирующими взаимодействие клеток друг с другом и клеток с матриксом[7].

Сфероиды имеют минимальное соотношение поверхности к объему. Силы поверхностного натяжения в наружном слое клеток минимизируют объем сфер. В отсутствие матрикса многие клетки внутри сфероида принимают самую экономичную в энергетическом отношении шаровидную форму[8]. Более того, сигнальная кооперация округлых клеток в сфероиде не только возвращает систему к ранним генам энтодермы, нейроэктодермы, но и активирует те ранние гены клеточной регенерации, которые работают в регенерационной ткани (бластеме)[9].

Практический интерес к мультиклеточным сфероидам как модулю функциональной ткани, полученной в лабораторных условиях, был разогрет тупиком в выращивании органов мелких лабораторных животных. Центральная масса переживающих ex vivo органов подвергалась гибели вследствие гипоксии с остановкой специализированных биохимических и регуляторных функций[10].

Термин «клеточные сфероиды» появился в научной литературе в начале 90-х годов прошлого столетия. До его появления в клеточной биологии, эмбриологии и биологии развития широко использовались два других термина: клеточные кластеры и клеточные агрегаты для характеристики ЗО-взаимодействий в новом тканевом измерении[11—14].

История вопроса

А. Каррель первым показал, что эксплантаты сердца и других органов способны не только переживать в культуре несколько месяцев, но и сохранять физиологические функции (ритмические сокращения)[11]. По этой причине А. Каррель сосредоточился на выращивании 3D «гисто-культур». В 50-х годах прошлого века J. Leighton добавил технологию ЗО-крупнопористого лабораторного матрикса для длительного выращивания клеток. На искусственном губчатом материале J. Leighton не только научился выращивать многие соматические линии клеток, но и первый показал, что раковые линии клеток на матриксе формировали шаровидные клеточные агрегаты (в отличие от нормальных клеток)[15—17]. Далее было продемонстрировано, что агрегаты менее чувствительны к цитотоксинам, радиации и гипоксии[18, 19]. Рост сфероидов раковых клеток в тканевых культурах связали с возникновением химио- и радиорезистентных клеточных метастазов. В дальнейшем было показано, что эпителиальные сферы лучше сохраняют специализированные характеристики, чем монослойные клеточные культуры. 20-культуры имели изменённую чувствительность к гормонам и ростовым факторам[20, 21].

Интерес к межклеточным взаимодействиям в раннем эмбриогенезе восходит к работам А. Москоны, посвященным селективной самоагрегации зародышевых клеток на базе высокоаффинного сродства поверхностных лигандов и комплементарных рецепторов[22, 23]. Идеи А. Москоны были далее развиты М. Стейнбергом в концепции морфогенеза органов и тканей, основанного на региональной дифференциальной адгезии клеток[24, 25]. В начале 60-х годов прошлого века П. Вайс проложил первый экспериментальный мост между 20-культурами клеток и ЗО-сборкой ткани в лабораторных условиях, применив в качестве матрикса биоиндуктивные пористые материалы. Началась эра лабораторной тканевой инженерии. ЗО-пористый биоматериал служил пространственной сигнальной матрицей для организованного заселения, миграции и дифференцировки незрелых прогениторов, сопряженных с организованной сборкой ткани. Зачастую создание «лабораторной ЗО-ткани» шло в обход эмбриогенеза и органогенеза.

Наконец, в последние два десятилетия бурно развивается концепция сфероидов (микротканей) как серийно повторяющихся клеточных модулей, воспроизводящих и накапливающих ключевые события эмбриогенеза[26]. Основу модулей составляют серийные копии многоклеточных агрегатов из эпителиальных и стромальных клеток. Вторым важным отличием сфероидов является отсутствие или минимальная доля компонентов экстрацеллюлярного матрикса. Сигналы микроокружения создают условия для длительного (несколько месяцев) выживания клеток в сфероидах. Выживание сфероидов не связано с их неоваскуляри-зацией. Увеличенная выживаемость клеток в сфероидах связана с минимизацией метаболизма, расходования АТФ и кислорода в 30-агрегатах по сравнению с монослойной культурой[27, 28].

В сфероидах округлые клетки минимально экспрессируют белки цитоскелета и аппарат клеточной адгезии. Это возвращает сфероидным клеткам чувствительность к ранним сигналам эмбриогенеза. Одновременно шаровидный статус клеток в отсутствии матрикса блокирует раннюю чувствительность клеток к сигналам цитодифференцировки[26].

Современная биология и медицина переживает фазу «бума» вокруг 30-технологий выращивания тканеподобных министруктур. Только исследования стволовых клеток сопоставимы по скорости накопления новых открытий и инноваций. В наше время идея сборки минимальных строительных блоков ткани размером 50100 мкм3 через спонтанную 30-агрегацию клеток in vitro обрастает множественными путями реализации[29, 30].

Первое очевидное преимущество этой технологии — возможность достичь плотности клеток на единицу объема, сопоставимую с плотностью клеток в органах[31]. Во-вторых, стало очевидным, что лабораторная реконструкция мини-ткани из паренхимо-стромальных модулей требует соответствующего осевого hard/soft-микроокружения. Лабораторные структуры типа смешанных мини-агрегатов стали использоваться для создания временной провизорной зародышевой и экстраэмбрио-нальной[32]. В-третьих, в силу отсутствия внеклеточного матрикса в сфероидах заблокирована дифферен-цировка шаровидных неприкрепленных клеток.

Характеристика сфероидов из переживающих миниэксплантатов фетальных и дефинитивных тканей

В культуре органных мини-эксплантатов выявляются общие закономерности реорганизации переживающей ткани. В первые 7 сут. происходит повреждение базальной мембраны, изменение полярности эпителиального монослоя, частичная гибель ткани. На примере культивирования дыхательного эпителия было продемонстрировано, что одновременно с морфологическими изменениями дыхательный эпителий терял молекулярные маркеры зрелости — трансмембранный регулятор ионной проводимости CETR-ZO-1 -ezrin комплекс и цилии[33]. Через несколько дней культивирования сформированные эпителиальные сфероиды демонстрировали восстановление утраченных молекулярных маркеров зрелости эпителия вместе с цилями. Признаки дифференцировки (в виде поляризованного цилиарного аппарата) хорошо сохранялись в сфероидах эпителия. Культивирование дыхательного эпителия только в виде плотных агрегатов сохраняло признаки терминальной дифференцировки клеток. Другие способы выращивания клеток в культуре вели к де-дифференцировке клеток[28].

Формирование сфероидов по периферии эксплантата в течение 3^5 нед.[34]. В течение первых 7 сут. эпителий терял апикально-базальную полярность одновременно с фрагментацией базальной мембраны, а также организованную структуру ацинусов и дуктул. В такой модели образование сфероидов — это согласованный ответ стромы и эпителия на повреждение ткани. Как правило, пролиферация стромы ограничена в сферах, формирующих один или несколько слоев эпителия. В то же время нарастает плотность межклеточных контактов, сопоставимая с контактами в исходной ткани.

Эксплантаты бронхиальной слизистой оболочки диаметром 400^500 мкм приобретали округлую форму в культуре и за 5 сут. формировали типичные сферы-агрегаты. Поверхностный слой был представлен эпителиальными цитокератин+-клетками, а также фрагментами базальной мембраны из коллагена IV типа, ламинина и фибронектина. Центральная часть сфер содержала фибробласты и межклеточный матрикс[36]. Сфероиды назального и бронхиального эпителия в течение 30^50 сут. культивирования сохраняют дифференцированный статус[36].

Клетки бронхосфер экспрессируют ранние гены эмбриогенеза и «стволовости», сохраняя одновременно клетки с признаками терминальной дифференцировки, в которых сохранялся в неактивном состоянии ген Slug, контролирующий эпителио-мезенхимальную перестройку клеток. Slug-экспрессирующие клетки подвергались одновременно дедифференцировке и эпителио-мезенхимальной трансформации[37].

Микроэкспланты (2x2 мм) скелетной мышцы человека (биопсийный материал) в ходе культивирования в неприкрепленном состоянии формировали сфероиды на поверхности срезов[38]. Регенерационные Зй-агрегаты (миосферы) были описаны двумя независимыми группами исследователей[39, 40]. Для выделения миосфер были использованы условия, близкие протоколу выделения нейросфер: среда DMEM/F12 с добавлением В27, EGF (20ng/ml) и bFGF (40 ng/ml). Растущие из прикрепленных миосфер клетки приобретали мезенхимальный статус и дифференцировались, главным образом, в эндотелиальные и гладкомышечные клетки. В другой работе суспензионные миосферы получали из первичной гетерогенной клеточной суспензии, состоящей из Seal + (60%), Всгр-1 + (85%), Myo D(15%), N-tubulin-3 (25%), GFAP (30%), Nkx2.5 (1%) позитивных клеток, а также side-популяция из Hoechst 33342-клеток. Эти гетерогенные клетки формировали плавающие миосферы в среде DMEM/F12 с добавлением 20% FBS[41]. Плотные агрегаты миогенных клеток появлялись на раневой поверхности миофибрилл уже через 5 сут. после культивирования биоптатов (1—2 мм) скелетных мышц[42]. Культивируя отпрепарированные миофибриллы из биоптата мышцы человека (биопсийный материал), мы через 5^7 сут. наблюдали образование сфероидов на краевых концах миофибрилл (рис. 1А). При адгезии сфероидов к пластику отмечали массовое выселение мелких полигональных клеток с последующим формированием новых мышечных трубочек (рис. 1Б).

Сфероиды из целого мозга 15-дневных фетусов крыс получали из отфильтрованной через фильтры (150 мкм) нервной ткани с последующим центрифугированием. Осажденные клетки в концентрации 10 млн/мл ре-суспендировали в среде DMEM с 10% FCS и культивировали при непрерывном помешивании на шейкере. В течение первой недели формировались рыхло упакованные сфероиды с множеством гетероморфных клеток. На периферии сфероидов и на стыке разных сфероидов накапливались в основном клетки округлой формы. Клетки сохранялись по периферии сфероидов в течение 3^5 нед. культивирования[43]. Центральную часть сфер занимали дифференцированные клетки глии и нейроны с отростками и синапсами.

При культивировании мини-эксплантатов коры больших полушарий человека 11 нед. развития, полученных, как и в предыдущей работе, с помощью фильтрации через фильтры (150 мкм) с последующим центрифугированием и культивированных в чашках Петри в среде DMEM/F12 с добавлением 2% FBS, В27, N2, EGF (10 ng/ml) и bFGF (10 ng/ml), нами было отмечено спонтанное формирование сфероидов на поверхности эксплантатов через 5^7 сут. культивирования (рис. 2 А., Б).

Эффективность и скорость формирования сфероидов возрастала, когда в культуру помещали крошечные субвентрикулярной ткани и других отделов мозга помещали в среду DMEM/F12, N2, В27 и глютамин. Уже через 24^48 ч кусочки эксплантатов реорганизовывались в нейросфероиды с бурной миграцией клеток из ткани[44]. В неприкрепленном состоянии эксплантаты росли до 4^5 мес. с сохранением фенотипа дифференцированных нейронов и глии. Очаги пролиферации в ткани идентифицировали по скоплению Ki-67+ клеток. Состояли они в основном из нестин+, виментин+, GFAP+-клеток[45].

Клетки стромы роговицы в норме синтезируют уникальные компоненты прозрачного матрикса. В случае активной пролиферации они теряют уникальные свойства и превращаются в обычные фибробласты, формирующие рубцовую ткань[46]. Для сохранения уникальных биохимических свойств первичные культуры модифицировали в сфероиды в бессывороточной среде с добавлением IGF1/bFGF в условиях, где прикрепление клеток к подложке было блокировано. В течение 7^10 первых сут. из монослоя возникали многослойные агрегаты. К концу 3-й нед. формировались плотные многослойные сфероиды диаметром 0,1—2 мм. Далее такие компактные сфероиды удавалось культивировать в течение нескольких месяцев без потери уникальных биохимических свойств составляющих их клеток. В этих сфероидах не были идентифицированы пролиферирующие популяции клеток[47]. Группа других исследователей обнаружила, что клетки внутри сфероидов из клеток стромы роговицы одновременно маркировались антителами к белкам мезенхимы и нейроэпителия[48].

Поврежденная сетчатка млекопитающих отвечает на повреждение новообразованием двух типов сфероидов: розетко-подобных и слоистых. Клетки пигментного эпителия являются главными участниками новообразования и трансдифференцировки клеток для слоистых сфероидов[49]. В ходе роллерного культивирования эксплантов сетчатки взрослых крыс были получены полые сфероиды. В зоне повреждения наблюдали формирование регенерационной ткани — агрегатов и розеток из клеток пигментного эпителия[50].

В 1994 г. было показано, что агрегаты постнаталь-ных энтероцитов и соединительной ткани подслизис-той основы тонкой кишки при трансплантации в ткани иммунодефицитных животных повторяли эктопическую сборку неомукозы тонкой кишки из диссоциированных клеток[51]. Несколько ранее — в 1992 г. был создан метод выращивания первичной суспензионной культуры энтероцитов и стромы[52]. Суспензию с высокой плотностью клеток выращивали на матригеле с периодическим центрифугированием для получения плотного пеллета. Процедуру дисперсии клеток и центрифугирования повторяли 5^8 раз до получения многоклеточных организованных сфер[53]. На 7-е сут. культивирования возникали многочисленные кавитированные агрегаты, выстланные изнутри высоким столбчатым поляризованным эпителием — дериватом исходных энтероцитов. Одновременно в просвете кист встречались уплощенные недифференцированные прогениторные клетки. В поляризованном эпителии были идентифицированы энтероциты с микроворсинчатой каймой, бокаловидные, энтероэндокринные и клетки Панета. В течение последующих 5 мес. культивирования кавитированные агрегаты периодически формировали упакованные зрелые типичные ворсинки и крипты. В своих опытах мы также наблюдали формирование организованных многослойных энтеросфероидов из диссоциированной ткани тонкой кишки человека через 4^5 сут. культивирования (рис. ЗА). Некоторые энтеросфероиды при дальнейшем культивировании формировали внутреннюю неолуминальную полость (рис. ЗБ).

Возникновение конденсированных агрегатов хонд-ропрогениторных или остеопрогениторных клеток наблюдали в развивающейся почке конечности млекопитающих. Далее клеточные агрегаты дифференцировались в хондрогенные или остеогенные узелки[54]. При повреждении хрящевой ткани зачатка конечности вьюна наблюдалось формирование сфер из хондропрогени-торных клеток в зоне повреждения[55]. В зоне повреждения костной ткани наблюдалось формирование гетерогенных сфероидов из мезенхимальных и остеопрогениторных клеток[56].

Не только повреждение, но и экспериментальные условия невесомости индуцируют формирование сфероидов. В условиях, способствующих формированию межклеточных контактов, клетки культуры эпителия протоков слюнной железы формировали плотные сфероиды на жидком геле из поливинилового спирта[57].

In vivo перевязка выводного протока слюнной железы является удобной воспроизводимой моделью повреждения ацинарного эпителия. После перевязки протока большинство ацинарных клеток погибает апоп-тозом. При этом из клеток дуктулярного эпителия наблюдалось формирование ЗО-сфероидов. Эпителиальные клетки сфероидов получали способность дифференцироваться в гепатоциты или островные клетки.

поджелудочной железы[58, 59]. Предполагается, что в образующихся сфероидах при повреждении дуктул появляются прогениторные клетки эктодермального генеза. Эти прогениторы энтодермы (CD29 + , CD49 + , CD90+, ламинин+, ЦК18+, ЦК19+, c-kit+) удалось перевести в культуру на коллагене I типа. Приведенные выше данные позволяют заключить, что механически поврежденные эксплантаты фетальных и дефинитивных тканей демонстрируют универсальную «реакцию на повреждение» в виде образования регенерационной ткани имеющих сфероидную организацию.

Сфероиды из диссоциированных клеток в суспензии

В начале 80-х годов XX в. было описано много линий раковых и соматических клеток взрослых, чувствительных и резистентных к спонтанной агрегации и образованию многоклеточных сфероидов. Преобладающая часть раковых и соматических линий сохраняли в культуре способность генерировать сфероиды в условиях полного блока прикрепления клеток к подложке[ВО].

В первую очередь получали сфероиды из разных соматических линий клеток выращиванием на поверхности низкоадгезивного агара[61]. Организованные сфероиды были получены впервые из диссоциированных клеток сетчатки. Благодаря клеткам мюллеровой глии, сферы сохраняли радиальный каркас и организованное послойное расположение клеток. После сквозных повреждений сетчатки часть мюллеровой глии формирует агрегаты округлых клеток в зонах повреждения. В дальнейшем клетки сфероидов дифференцировались в линии нейронов[62]. Очевидно, что агрегаты клеток глии играют роль регенерирующего модуля из плюрипотентных клеток.

Диссоциированные клетки фетального головного мозга и мозжечка также хорошо формировали сфероиды, но расположение клеток в них не было радиально или послойно организованным[63]. Описаны методы получения кластеров разного размера из диссоциированных клеток эмбрионального головного мозга человека. Кластеры содержали нейроны, глию и нейральные стволовые клетки[64]. Сфероиды, выделенные из суммарной ткани головного мозга крыс, характеризовались преобладанием в клетках опережающей экспрессии регуляторных генов и наличием белков различных сигнальных сетей[43]. Вероятно, такие провизорные структуры головного мозга служат для накопления новой регуляторной эпигеномной памяти.

Сфероиды из эпителиальных клеток были получены в ходе культивирования диссоциированных биопсийных эксплантов 12-перстной кишки. Они использовались для изучения анионо-катионного транспорта[65].

Прикрепленные к подложке соматические дифференцированные клетки, а также стволовые и Сили) прогениторные клетки существенно меняли фенотип и поведение, присущее им в тканях. Оказалась, что плотные сфероиды ММСК, полученные агрегацией клеток, гораздо лучше сохраняли тканевые особенности[66]. Формируя плотные клеточные агрегаты, стро-мальные прогениторные клетки не только хорошо и длительно сохраняют фенотип, но и реэкспрессируют целые блоки ранних генов эмбриогенеза. Поэтому сфероиды ММСК сейчас широко используют для получения энтодермы, нейроэктодермы и нейросфер.

В отсутствии сыворотки часть ММСК образует сферы над монослоем стромальных клеток. Незрелые сфероиды маркируются экспрессией Oct4/Sox2. По-видимому, в отсутствии сыворотки и матрикса, образуются ранние плюрипотентные клетки, способные участвовать в регенерации ткани. Эти клетки обладают максимальным потенциалом к дифференцировке в разных условиях микроокружения[67].

Незрелые стромальные прогениторы, выделенные энзиматической диссоциацией из тканей аорты и крупных артерий, формируют весьма гомогенные сферы из Ngn2+, нестин+, PDGFA+, PDGFB+-icneTOK в среде с bFGF, но без сыворотки[68]. Как известно, набор перечисленных маркеров характеризует перициты. Добавление bFGF необходимо для блокирования адгезии незрелых клеток к подложке. Значительное число эндотелиальных клеток первичной культуры или клеток первых пассажей способны формировать сфероиды. После прикрепления на матригель, желатин или фибрин сфероиды формируют трехмерную сеть капилляров, вырастающих из каждой сферы[69].

Сфероиды из гепатоцитов печени взрослых животных характеризовались минимальной скоростью по-лиферации (более 80% клеток в стадии G0). В плотном контакте гепатоциты долго сохраняли признаки биохимической и функциональной дифференцировки. Из 242 генов специализированной биохимической и физиологической функции около 80% сохраняли активность в сфероидах из гепатоцитов[70]. После прикрепления к подложке гепатоциты начинали пролиферировать, формируя монослой. Однако в монослое гепатоциты теряли признаки биохимической специализации[71]. Очевидно, гепатоциты в статусе сфероидов более активно участвуют в регенерации локальных повреждений печени по сравнению с гепатоцитами, выращенными в монослое.

Трансплантаты хромаффинных клеток надпочечника в виде агрегатов выживали лучше и давали больший терапевтический эффект (чем одиночные диссоциированные клетки) после их трансплантации в средний мозг крыс с моделированной болезнью Паркинсона. Контрольные гистологические исследования показали хорошую выживаемость агрегатов в ткани мозга[72].

Сфероиды из кардиомиоцитов хорошо выживали и сохраняли ритмическую контрактильность в культуре. Кардиомиоциты взаимодействовали с ММСК или эндотелиальными клетками в суспензии, формируя гетерогенные сфероиды. Большинство стромальных клеток в сфероидах дифференцировались в эндотелиальные клетки, которые реорганизовывались в капиллярные сети[73].

Таким образом, диссоциированные клетки органов и тканей, подобно тканевым эксплантатам, демонстрируют универсальную способность формировать сфероиды в ЗО-культуре. Эта способность поврежденных тканей формировать репаративные агрегаты сохраняется в изолированных клетках органов.

Эпителио-мезенхимальная пластичность (конверсия) в 3D культурах

Предполагается, что образование тканей и органов, как и репарация органов, требуют постоянного перехода мезенхимы в эпителий и наоборот. В органах с высоким темпом репарации частота таких переходов резко возрастает[2].

В эмбриогенезе пласты эпителиальных клеток в кооперации со стромой подвергаются обратимой 3D-реорганизации в ходе формирования основных дефинитивных органов и тканей. Динамика и пластичность эпителиальных структур находится в эпицентре конденсации, паттернинга, осевого морфогенеза и органогенеза[4, 74].

Интерес к эпителио-мезенхимальным обратимым конверсиям в эмбриогенезе стал быстро развиваться после классических исследований К. Гробстайна, посвященных самосборке клеток эпителиальных органов в эмбриогенезе[75]. Многолетние исследования в этом направлении завершились фундаментальным выводами: 1) органогенез млекопитающих и человека сопровождается селективным взаимодействием эпителиальных и стромальных клеток; 2) мезенхима играет роль сигнального индуктора в осевой закладке и паттернинге желез; 3) развитие эпителия органов зависит от серии сигналов подлежащей стромы; 4) взаимодействие эпителия и мезенхимы имеет форму сигнального диалога. Строма индуцирует Зй-заклад-ку/паттернинг, тогда как эпителий контролирует терминальную дифференцировку стромы[76].

Еще недавно казалось, что многоступенчатый диалог эпителия и мезенхимы волосяного фолликула не удастся воспроизвести современными средствами[77]. Для этого потребовалось использовать Зй-мик-росферы дермальных папиллярных фибробластов и кератиноциты внешнего слоя фолликула. В такой 3D-микромодели удалось воспроизвести пространственновременной порядок эпителио-мезенхимальных взаимодействий в зачатке фолликула.

Локальное разветвление эпителия протоков слюнной и других желез контролируется сигнальным стро-мальным микроокружением. Инкубация слюнной железы мыши с Noggin (блокатор ВМР-7) приводит к значительному уменьшению числа бифуркаций протокового эпителия. Аналогично этому, мутантные новорожденные ВМР-7-/- мыши имеют слабо разветвленный эпителий протоков слюнных желез[78]. В то же время инкубация эксплантатов слюнной железы с ВМР-7 приводит к гиперразветвленности эпителия железы. Было показано, что ВМР-7 не изменяет скорости пролиферации дуктулярного эпителия. Однако ВМР-7 сильно активировал образование стромальных клеточных агрегатов в зонах будущих бифуркаций. Оказалось, что агрегаты стромы являются предшественниками локального эпителия, инициирующего ветвление тубул.

650 клеток эпителиального пласта эпибласта являются предшественницами клеток зародышевых слоев и экстраэмбриональных тканей. По-видимому, все мезенхимальные клетки гаструлы и постгаструлы возникают из эпителиальных клеток[79].

Гаструла — это сбалансированная эпителио-мезенхимальная зародышевая ткань, собранная из плюри-потентных клеток. За сутки в ней возникает более 8000 новых клеток с временем удвоения 5 ч, главным образом, за счет перехода эпителиальных клеток в мезенхимный статус. В ходе раннего эмбриогенеза мезенхимальные клетки образуются в гаструле через примитивную полоску и узелок путем эпителио-мезенхи-мальной конверсии. Кроме того, часть клеток нейроэпителия нервной трубки и нервного гребня формируют нейромезенхиму. Впервые идея динамической организации фенотипа клеток зародышевых листков была сформулирована 3. Хэй в середине 90-х прошлого века[80, 81]. Если эпителий эпибласта способен генерировать мезенхиму через примитивную полоску или узелок, то зародышевые ткани гаструлы способны генерировать эпителий и мезенхиму из общих клеток предшественников. Основу временной эпителио-мезен-химальной пластичности ранних зародышевых тканей составляют провизорные сфероидные агрегаты с маркерами эпителия и мезенхимы. И объясняется это следующим. Во-первых, статус шаровидных клеток блокирует образование локального внеклеточного матрикса. Во-вторых, плотные межклеточные коннекси-новые контакты индуцируют экспрессию ранних генов органогенеза, блокируя гены терминальной дифференцировки клеточных линий. В-третьих, зародышевые ткани постгаструлы наделены автоматическими программами взаимопревращений эпителия в мезенхиму и наоборот (вторичные эпителио-мезенхимо-эпители-альные переходы)[82]. В одном и том же зачатке мезенхима может генерировать эпителий и, наоборот, строма генерирует паренхиму органов. Исследования эпителиальных и стромальных линий in vitro показывают, что способностью к обратимой конверсии наделены не все клетки в культуре. Лишь часть клеток образует модули для эпителио-стромальных либо ме-зенхимо-эпителиальных конверсий[79]. В части сомитов клетки мезенхимы становятся мышечными клетками. Мезенхимальные прогениторы зачатка почки переходят в дуктулярный эпителий. Мезенхима поджелудочной железы служит предшественником эпителия протоков. Генетическая и сигнальная программа этих конверсий сложна и упакована в несколько разных «файлов».

В тканях взрослых организмов эпителио-мезенхимальная конверсия клеток индуцируется локальным повреждением и гибелью эпителиальных клеток. Независимо от генов Snail/Slug/Twist, в цитоплазме нарастает концентрация транскрипционного фактора FoxC2, который подготавливает смену фенотипа частично поврежденных эпителиальных клеток[83]. Однако длительная высокая экспрессия FoxC2 отмечена только в тех мезенхимальных субпопуляциях, которые подвергаются мезенхимо-эпителиальному переходу в зоне повреждения. Показано, что FoxC2 активирует синтез Е-кадгерина, белков базальной мембраны. Экспрессия FoxC2 маркирует локально те кластеры, которые участвуют в реэпителизации повреждений. У мышей с двойной гомоделецией гена Slug (Snail2) полностью исчезала возможность перехода дермаль-ных фибробластов в эпителий[84].

Приведенные данные свидетельствуют о том, что ЗО-сфероиды могут являться уникальным многоклеточным модулем, в котором активно идет обратимая эпителио-мезенхимальная конверсия клеток, сопровождающаяся их генетическим репрограммированием, а следовательно, удобной моделью для изучения этого феномена.

Сфероиды из ЭСК

Пролиферация ЭСК в суспензионной культуре при высокой плотности клеток происходит, главным образом, в спонтанных агрегатах (кластерах) ЭСК в чашках из низко адгезивного материала (бактериальные чашки, гидрогели). Спонтанную дифференцировку прогени-торных клеток в агрегатах блокируют своевременным пипетированием, разрушающим контакты «клетка-клетка». В таких условиях удается поддерживать пролиферацию ЭСК в 10—15 пассажах, сохраняя неизменным недифференцированный статус и максимальную плюрипотентность клеток[85, 86]. ЗО-выращивание ЭСК в сферах над матригелем позволяло на выходе получать в 2^4 раза больше плюрипотентых клеток, чем традиционный способ выращивания ЭСК над фидером[87]. Агрегаты ЭСК на фидере из фибробластов сохраняли плюрипотентность даже при очень высоких уровнях плотности клеток в культуре[88]. В случае миникультуры в 96-ячеечных микровеллах (дно которых было покрыто матригелем) удавалось поддерживать в течение 10—15 пассажей недифференцированный статус клеток в кластерах ЭСК в микро-масштабе[89]. Прикрепленные агрегаты ЭСК сохраняли высокую пролиферацию без дифференцировки на малоадгезивном ЗО-матриксе из поликапролактона[90]. Отсутствие рецепторов клеточной адгезии и соответствующего цитоскелета позволяло сфероидным клеткам сохранять примитивный фенотип. Гиалуроновая кислота, пористый полиэтилентетрафталат, ЗО-поли-капролактон являются малоадгезивными субстратами, на которых слабо прикрепленные агрегаты ЭСК активно пролиферировали, сохраняя полный потенциал развития[90—92].

Было показано, что агрегаты клеток линии NT-2 тератокарциномы гораздо быстрей и эффективней дифференцируются в нейроны в суспензии, чем те же клетки в монослое[93]. Полную количественную конверсию клеток NT-2 в нейроны получали за 24^28 дней без примеси опухолевых клеток.

Возникающие при культивировании агрегаты эпителиальных линий ЭСК, как правило, содержат одновременно клетки в эпителиальном и мезенхимальном статусе.

В нескольких лабораториях удалось проследить возникновение прогениторных клеток в мезенхимальном статусе из исходных ЭСК в эпителиальном статусе [94—97]. Однако никому не удалось получить типичные мезенхимальные клетки в культуре из мезодер-мальных прогениторов. Многие линии ЭСК также содержали клетки со смешанным набором маркеров эпителия и стромы. Такие культуры после прикрепления одновременно формируют эпителиальные и мезенхимальные колонии. Обе популяции сохраняли плюрипотентность[98]. Образование мигрирующих клеток в мезенхимальном статусе наблюдали в плоских дискоидных эпителиальных колониях, растущих над фидером из фибробластов[99]. Зоны эпителио-мезенхимальной конверсии в колониях маркировали по появлению Snail2+, Brachyury+ одиночных свободно мигрирующих клеток. Новообразованные мезенхимальные клетки теряли поверхностный Е-кадгерин и белки межклеточных контактов (ZO-1). Мигрирующие одиночные клетки заселяли глубокие слои фидера из фибробластов (имитация примитивной полоски и мезодермы).

На эпителиальных линиях ЭСК было показано, что клоногенные плюрипотентные ЭСК генерируют смешанные эпителио-мезенхимальные агрегаты, регенерационный потенциал которых сопоставим со сфероидами, получаемыми из быстро обновляемых тканей. Зпите-лио-мезенхимальная конверсия была изучена прицельно на уровне отдельных прикрепленных колоний. Этот переход отличался следующими особенностями: 1) в новообразованных мезенхимальных клетках (м-клетки) идентифицирована экспрессия Twist и SnaiH; 2) новообразованные м-клетки теряют Е-кад-герин, но экспрессируют заново виментин, фибронек-тин и N-кадгерин. Плотная упаковка клеток в агрегатах является необходимой предпосылкой дифференцировки трофэктодермы и энтодермы. Образование примитивной энтодермы значительно ускорялось в суспензионных супер-агрегатах эмбриобласта, выделенных сразу от 4^5 зародышей[100]. Возникновение энтодермы через спонтанную агрегацию ЭСК в суспензии, автоматически блокировало образование эктодермы и мезодермы в силу антагонизма двух генов — Nanog и Dppa4[101].

Таким образом, в сфероидах из плюрипотентных стволовых клеток наблюдаются спонтанные и индуцированные обратимые эпителио-мезенхимальные переходы. Роль этих переходов в развитии остается недостаточно изученной.

Сфероиды из ММСК

Стандартным методом поддержания линии ММСК in vitro является адгезированная 20-культура. В ответ на специфические сигналы от факторов, находящихся в основной ростовой среде, ММСК способны дифференцироваться в трех основных направлениях — остеогенном, хондрогенном и адипогенном. При особых условиях возможна индукция экспрессии маркеров мышечных и нервных клеток, однако полноценных функционирующих клеток при этом не образуется[102]. Поэтому 20-культивирование может являться лишь основным способом масштабирования ММСК in vitro.

Наиболее простыми в своей реализации способами получения сфероидов как ММСК, так и других типов клеток являются: культуры в «висячих каплях»[103, 104]; получение агрегатов путем компактизации клеток при центрифугировании на низких скоростях в 15-мл полипропиленовых конических центрифужных пробирках[105, 106] или культивирование в 96-лу-ночных платах с V-образным дном, покрытым полипропиленом[107, 108].

Ключевую роль в образовании сфероидов, как и в эмбриональном развитии и морфогенезе органов, играют молекулы клеточной адгезии. Можно выделить три стадии в процессе формирования сфероидов (рис. 4)[109]. На первой стадии клетки расположены рыхло, контакты между клетками и внеклеточным матриксом обусловлены взаимодействием между RGD-последовательностями на белках матрикса и интегринами на клеточной поверхности. Следующая стадия связана с постепенным накоплением Е-кадгерина на поверхности клеток, в результате чего, на третьем этапе, возникают кадгерин-кадгериновые межклеточные контакты, и образуется плотный агрегат.

В связи с плотной упаковкой клеток и отсутствием сосудов в крупных агрегатах могут возникнуть затруднения диффузии питательных веществ и, в особенности, кислорода к центральным клеткам. Если диаметр агрегата превышает 200^250 мкм, возникает градиент концентрации кислорода с наименьшим его количеством в центре агрегата[110, 111]. Помимо этого, в крупных агрегатах накапливаются углекислый газ и продукты жизнедеятельности клеток. Учитывая все эти факторы, агрегаты размером более 500 мкм в диаметре можно условно подразделить на несколько слоев: в центре находится зона погибших клеток, окруженная внутренним слоем живых клеток, относительно неизменным, и, наконец, снаружи расположены активно пролиферирующие клетки (рис. 5)[29].

В своих опытах для получения ММСК сфероидов использовали метод «висячая капля». Клетки культивировали в «висячих каплях» в стандартных условиях (37°С, 5% С02) в течение 3-6 сут. Подобранная концентрация клеток и условия культивирования[104] позволяют получать сфероиды размером 100^150 мкм, что обеспечивает высокий уровень жизнеспособности клеток сфероида в течение всего периода культивирования. Отдельные агрегаты после пяти суток культивирования в «висячих каплях» помещали на пластик, получая вторично прикрепленные культуры.

На третий день ведения 3D культуры формировались небольшие (20^30 мкм), рыхлые по своей структуре скопления клеток. Большая часть клеток, помещенных в каплю, на третий день в состав агрегата не входила. К шестому дню практически все скопления и разрозненные клетки объединялись и формировали одиночные агрегаты, достигавшие 100^150 мкм. По своей структуре к шестому дню культивирования в «висячей капле» агрегат становился плотным, с более гладкой поверхностью (рис. 6).

Иммуноцитохимическое исследование позволило выявить усиление экспрессии нестина и компонентов базальной мембраны — коллагена IV типа (рис. 7) и ламинина на периферии ММСК сфероидов (рис. 8). При дальнейшем культивировании отмечались процессы поляризации сфероидов и синтеза элементов внеклеточного матрикса. Клетки в сфероидах, преимущественно на поверхности, экспрессировали не только эпителиальные маркеры, но и мезенхимальные — CD105 и виментин. Наблюдалась также экспрессия GATA-6 и нестина — маркеров примитивной энтодермы и нейроэктодермы.

Зпителиоподобная морфология клеток и ламина-ция ЗО-культуры подтверждены методами сканирующей электронной микроскопии и трансмиссионной электронной микроскопии. По своей структуре сфероиды состоят из плотно упакованных шаровидных клеток (рис. 9). Вытянутая форма и тесное прилегание клеток поверхностного слоя друг к другу свидетельствуют о протекающей поляризации клеточного слоя (рис. 10).

При помещении сфер на 5 сут. культивирования в «висячей капле» в обычную чашку Петри наблюдалась адгезия сфероидов к пластику, после чего начиналось выселение и миграция эпителиоподобных клеток из состава сфероидов, что свидетельствует о сохранении эпителиального статуса внешнего слоя клеток сфероидов[рис. 11).

Добавление ламинина (использовались чашки Петри, покрытые ламинином) приводило к активации миграции клеток в течение первых 10ч после адгезии сфероидов к пластику. При этом не было отмечено изменений в миграции клеток сфероидов, помещенных на другие компоненты базального матрикса и фибронектин. Быструю миграцию клеток, вероятно, можно объяснить стимуляцией экспрессии GATA-6, что в свою очередь, приводит к активации R0CK/Cdc42 и реорганизации цитоскелета быстро мигрирующих клеток. Это говорит о возможном появлении примитивной энтодермы в сфероидах.

По-видимому, в 20-культуре происходит однонаправленный эпителио-стромальный переход. ЗО-культиви-рование ММСК индуцирует стромально-эпителиальный переход статуса клеток и активацию экспрессии ранних генов эмбриогенеза.

ЗD-культивирование ММСК/ЗСК, таким образом, открывает беспрецедентные возможности изучения раннего соматического эмбриогенеза млекопитающих и человека и механизмов согласованного ответа на повреждения тканей.

Подняться вверх сайта